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【技术文章】PCR实验中,这些点你get到了吗

发布时间:2020-09-15 阅读次数:46
PCR简介

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术是基因扩增技术的一次重大革新,是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。自20世纪80年代初发展以来,因其具有敏感度高、特异性强、快速简便等特点,在分子生物学、医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。

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PCR 技术发展史简图

二、PCR反应前注意事项

1,模板的用量

模板的用量往往取决于模板类型和反应体系。以50 μl反应体系为例,人基因组DNA,建议起始量为0.1-1.0 μg;大肠杆菌基因组DNA,10-100 ng;λDNA,0.5-5 ng;质粒或病毒DNA,0.1-10 ng。浓度过高会导致非特异性扩增,过低会导致产物量下降。正常情况下,适当提高模板浓度,减少循环次数,可提高PCR扩增的保真度。

2,模板完整性

模板的完整性主要是通过核酸电泳来判断,电泳结果若在23 kb左右有一条完整条带,则证明DNA完整性比较好。电泳结果中若出现弥散或无明显条带,则DNA可能发生降解。

3,模板的纯度

模板的纯度一般通过分光光度计测定,通常OD260/OD280比值在1.8~2.0认为DNA的纯度比较好,大于2.0可能存在RNA污染,小于1.8可能存在蛋白质污染。另外,模板中如果有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等的污染,会大大降低扩增效率。

引物

1,引物设计

在PCR扩增时,引物是决定扩增特异性与产量的最重要因素之一,所以引物序列的设计尤为重要。通常可借助引物设计软件辅助引物设计,比如NCBI网站的Primer BLAST在线工具、Primer 5在线工具、Primer Premier引物设计软件、Oligo 引物设计软件等。另外,小编也整理了一份引物设计原则供小伙伴们参考:

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2,引物使用建议

终浓度要求在0.1-1 μM,通常使用0.2 μM。对于简并引物、随机引物,可适当增加引物使用量,切记用量不要过高,否则会降低PCR的特异性。若模板量多且结构复杂(如人基因组DNA)时,适量减少引物用量提高特异性;反之,模板量少(如质粒模板)时,适当增加引物用量,提高PCR产量。

PCR 试剂

PCR反应除了模板和引物外,还需要准备DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、反应缓冲液和稳定剂等组份按照一定配比组成的试剂作为反应环境。为了实验的方便性,商业化PCR试剂大多做成2x即用型PCR Mix,大大节约了加样时间、最大限度地减少了人为误差、降低污染几率。市面上存的的PCR种类也比较多,需要根据实验的目的不同选择适合的PCR Mix,小编根据实验经验总结了以下建议,供参考:

a,菌液或质粒等PCR验证实验建议首选常规PCR mix;

b,多重PCR、高特异性PCR或高通量实验时建议首选热启动PCR mix;

c,长片段扩增(≥10kb)时首选长片段PCR mix;

d,在分子克隆、测序和定点突变、SNP等保真度需求高的实验时首选高保真或超保真PCR mix;

e,复杂模板或高GC含量的模板扩增时首选高GC或超保真 PCR mix。

若扩增效果不是很理想,可以尝试加入甲酰胺或二甲基亚砜(DMSO),并以0.5 mM梯度递增镁离子浓度,最高到4 mM进行优化体系时。

三、PCR反应程序

PCR 反应在预变性之后就进入一个重复过程,这个重复过程主要包括三个关键步骤,模板的加热变性、引物与单链模板的复性以及在热稳定DNA聚合酶的作用下复制延伸。整个重复过程结束后可选择增加终延伸,主要是对产物不完整末端的填补,确保全长复制以及高目标DNA片段的得率,同时,Taq DNA聚合酶的“加A尾”反应也在此步进行。

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变性

1,预变性

通常预变性温度为94 ℃-98 ℃,反应时间一般1-10 min。根据DNA聚合酶不同选择适合的预变性温度及反应时间是PCR反应顺利进行的关键,充分的预变性有利于DNA双链的打开。高GC等复杂模板,根据DNA酶的耐热性情况可适当提高预变性温度。

2,变性

通常变性温度为94-98 ℃ 孵育10-60 s,取决于DNA聚合酶的耐热性、模板复杂度、目的片段的长度等。

退火

退火温度取决于引物的Tm值,通常为50~60 ℃(Tm ± 5 ℃),退火时间一般为10 s - 1 min。

适当提高退火温度,可以相对减少非特异性扩增,但会降低产量;适当降低退火温度,可以提高产量,但会降低特异性,根据实验的具体情况可以进行相应的调整。

延伸

一般延伸温度范围在68-78 ℃之间,通常设置为72℃,取决于聚合酶活性,延伸时间取决于目的片段长度及聚合酶的延伸速度。

循环数

通常为25-40,取决于DNA起始量、DNA聚合酶的扩增效率和目的片段的得率等。DNA起始量低,建议适当增加循环次数。循环数过多会增加PCR结果的碱基错误率。

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