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【新闻动态】揭秘蛋白纯化及制备过程中沉淀的形成

发布时间:2020-11-11 阅读次数:95

蛋白发生沉淀的类型

        蛋白质的水化膜遭到破坏或者中和了表面的净电荷后形成的沉淀往往是可逆的,这在蛋白盐析,蛋白等电沉淀中最为常见,利用这一特性也常用来分离纯化蛋白。这也可以理解为蛋白分子的物理状态发生了变化,这种聚集沉淀是可逆的。

 蛋白分子在遭到剧烈的物理化学(如高温,极端pH等)作用时,分子中的次级键遭到破坏断裂,导致空间构象从紧密有序的变为松散无序的状态,这种清况下形成的沉淀是不可逆的,蛋白发生不可逆变性。这种沉淀也可以理解为蛋白分子发生了化学本质的变化。

     对沉淀后的蛋白分子进行生物活性鉴定即可判断蛋白沉淀的类型,物理状态变化引起的沉淀具有原生物活性,化学本质变性引起的沉淀无原生物活性。更多时是先发生可逆的物理变性沉淀,物理变性沉淀积累到一定量导致发生不可逆的化学变性沉淀。

蛋白发生沉淀的原因

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蛋白特性

      如膜蛋白及一些疏水性强的蛋白就很容易发生疏水聚集而沉淀。这从我们做膜蛋白提取以及包涵体溶解时都有深刻体会。

 

      在表达含有二硫键键的蛋白时特别容易形成包涵体蛋白。所以蛋白的氨基酸序列中,含硫氨基酸较多时也容易形成沉淀。蛋白结构中脯氨酸的含量增多也容易形成沉淀。

02

 

pH

蛋白质大多数都在高pH时溶解性高,低pH时易沉淀。这可能与氢键的形成有关。但有时候更低pH时蛋白又溶解了。这一现象在我们用亲和层析纯化抗体时特别常见。

03

 

盐浓度

      就是盐析效应。高浓度的盐破坏蛋白的水化膜,使得蛋白质聚集沉淀。常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏,再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG同时,硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。

04

 

有机溶剂

      丙酮沉淀等。但有机溶剂也不是全部对蛋白起沉淀作用,有时候也有助溶作用。例如有些膜蛋白用有机溶剂抽提。

05

 

温度

      高温或低温都有可能使得蛋白质沉淀。煮沸沉淀常见了,低温沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。

06

 

表面活性剂

     对蛋白质有助溶作用。例如做电泳时SDS就是很强的表面活性剂。还有TWEEN,Triton等等。

07

 

还原剂

      还原剂往往对蛋白质有助溶作用。有些蛋白当加入的还原剂在空气中慢慢氧化后,就会沉淀析出。

08

 

变性剂

       如尿素、盐酸胍。包涵体蛋白在用变性剂溶解后,再去除变性剂经常会沉淀析出。

利用蛋白发生沉淀进行蛋白纯化

      在蛋白质水溶液中,加入了高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等而使蛋白质从溶液中析出,称为盐析。

      在确定蛋白的pI后,用弱酸/弱碱(如碳酸钠等)缓慢滴加到蛋白溶液中,使溶液pHpI一致,即可沉淀出目标蛋白,称为等电沉淀。

      盐析及等电沉淀在蛋白纯化中都广泛被使用。

如何避免不可逆变性沉淀的发生

      在蛋白纯化开始之前要对其进行稳定性研究,温度,pH,离子强度,添加剂及浓度的稳定性研究一定要在纯化蛋白之前就进行有效可靠的验证。

 

      对温度敏感型蛋白的纯化制备尽可能在4度的环境中进行。同时对耐高温的蛋白如糖化酶,可以利用此特性来在高温下让其它杂蛋白变性沉淀,目标蛋白活性无影响这一特性来纯化蛋白。

 

      蛋白存在体系避免剧烈变化,在包涵体复性的过程有深刻体系,梯度逐渐减少变性剂可提高复性率。所以我们在纯化蛋白时就要避免体系的剧烈变化。

 

      亲和层析纯化蛋白时,大多需要较低的pH洗脱,在收集洗脱峰的容器中垫缓冲液(常用1MTris),让洗脱下来的蛋白迅速恢复到中性环境。避免纯化过程中蛋白发生沉淀。

 

       总而言之,在蛋白纯化及制备过程中,选择温和的操作环境,换缓冲液交换过程要缓慢,避免剧烈操作。另外在制备过程中也可以尝试加一些增溶剂,尿素,精氨酸等。也可尝试加还原剂DTT,B-ME等。也可以加EDTA避免蛋白的降解。

蛋白纯化过程沉淀的处理

      发生可逆沉淀后,我们可以尝试通过增加溶剂,调节pH,添加助溶剂等方式来处理。

       

      若发生不可逆沉淀,可以选择离心,过滤等方式去除。

注:内容出自生物制药

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